在细胞中,胶原蛋白以前胶原的形式分泌这些链被运输到内质网,在那里,大量的翻译后修饰导致了内质网的形成具有二硫键的三螺旋结构。胶原蛋白的过度产生与病理状况有关,包括肝硬化、肺结核和肺结核纤维化和生长。BioVision的胶原蛋白检测试剂盒是一种简单、灵敏的检测多种蛋白质中少量胶原蛋白的检测试剂盒样品的数量。该分析基于样品酸水解形成水解物和羟脯氨酸。这释放了羟脯氨酸氧化形成反应中间体,在反应中进一步形成发色团(Abs 560 nm)。
那么,如何选择快速方便的胶原蛋白检测试剂盒试剂盒呢?接下来小艾要介绍的这款胶原蛋白检测试剂盒 检测方法简单,对胶原蛋白敏感且特异,可在各种样本(如组织匀浆)中检测到低至0.5µg的胶原蛋白,生物液体和纯化蛋白质。
艾美捷 胶原蛋白检测试剂盒检测方案:
1、样品制备:组织或蛋白质/肽样品:组织样品(即肺)应在ddH2O中均匀化,使用100µl
每10 mg组织使用ddH2O。向100µl样品匀浆中添加100µl浓HCl(~12 M,未提供),并将其放入一个压力合适的聚丙烯螺旋盖小瓶中。在120°C下水解样品3小时(见注释C)。尿液:用等量水水解样品压力密封聚丙烯螺旋盖小瓶中12m浓HCl(即100µl尿液+100µl HCl)的体积。之后均质,通过添加4 mg活性炭,用活性炭澄清样品。以10000 x g的速度旋转并离心3小时至少清除沉淀和活性炭。如果需要,重复上述步骤。将2-30µl各水解样品转移至96孔板中,并通过在热板/干热块或微孔板培养箱上70°C加热板蒸发至干燥。
2、标准品制备:将25µl胶原蛋白I标准品转移到一个带螺丝帽的压力密封聚丙烯小瓶中,并添加25µl胶原蛋白12 M浓盐酸(未提供)。牢固拧紧盖并在120°C下水解3小时。在冰上冷却小瓶,然后旋转小瓶内容物(终体积为50µl,终浓度为1 mg/ml水解胶原蛋白)。添加0、2、4、6、8和10µl的1mg/ml水解I型胶原标准溶液放入96孔板中的一系列孔中,生成0、2、4、6、8和10的当量µg胶原蛋白/孔。通过在热板/干热块上70°C加热板,将标准曲线井蒸发至干燥,或微孔板培养箱。注:为防止微孔板塑料翘曲/蚀刻,请勿将微孔板暴露在J端温度(>85°C)下。如果天气炎热使用平板/烤箱时,我们建议将微孔板放置在70°C下,直到内容物完全蒸发
3、反应:向每个样品和标准品中添加100µl氯胺T试剂,并在室温下培养10分钟。添加向每个孔中加入100µl DMAB试剂,并在60°C下培养90分钟。
4、测量:将板从热源上取下,并在560处测量所有样品和标准曲线孔的吸光度端点模式下的nm(OD560)。对于大信号强度,在将板从加热炉中取出后20分钟内测量吸光度
5、计算:对于胶原蛋白标准曲线,从所有标准中减去零标准(0μg/孔试剂空白)读数
,绘制背景减去值并计算标准曲线的斜率。对于测试样品,减去零从样品读数中读取标准(0μg/孔试剂空白),并将背景减去的OD560值应用于标准曲线,以在井中获得Bμg胶原蛋白。